荧光蛋白最常见的用法是将其作为报告基因（关于报告基因的详细内容可查阅文章“飞萤流光，涟曳红尘”），用于亚细胞定位实验、遗传转化的可视化实验等，今天伯小远想介绍一种荧光蛋白的升级用法，即用其作为基因编码荧光探针（Genetically encoded probes）的报告元件。
图1 荧光蛋白的各种变体。GFP来自于维多利亚多管发光水母，它在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，在509nm处有发射峰，科学家们首先完成了S65T的突变，提高了GFP的荧光强度和稳定性，主激发峰从395nm迁移至488nm，而发射峰保持不变，随后的F64L突变进一步增强了发射强度，称为常用的增强型GFP（eGFP）。目前已发展出多种颜色的GFP突变体，作为报告蛋白。
什么是基因编码荧光探针呢？它其实就是工程化的荧光蛋白，通过多肽链将报告元件荧光蛋白与识别元件即特定的蛋白分子连接，针对各种物质如离子、代谢物、激素等开发，用于量化和可视化这些物质的分布及动力学变化等。基因编码荧光探针对周围的环境非常敏感，被检测物质的变化会影响基因编码荧光探针的荧光性质，从而改变探针的荧光强度，所以我们可以根据荧光的相对变化来实现对被检测物质的定量测量（表1）。
表1 植物学中用于指示离子、代谢物、转运蛋白的探针列表 (Sadoine et al., 2021)。
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在基因编码荧光探针出现之前，经常是使用化学荧光探针来检测分子，例如在植物研究中经常使用的ROS荧光探针、NO荧光探针等。化学荧光探针可以快速载入细胞、组织中，快速获取实验结果，但一般亚细胞定位不准确，而且化学染料对细胞会造成毒害、另外染料在细胞中只能短暂驻留，无法长时间观察被检测的物质。
与非基因编码探针（染料类、材料类）相比，基因编码荧光探针可以通过瞬转或稳定转化进入细胞，具有低毒性、低背景、可定位特定细胞亚细胞结构或特定细胞、可长时间进行荧光观察等优点，可在活体条件下实时测量天然细胞内环境中特定的分子，在生命科学基础研究中具有无可比拟的优势。
Ca2+
钙指示剂是研究钙信号转导中必不可少的工具。基因编码的钙指示剂是将荧光蛋白与钙结合蛋白融合，钙结合蛋白可以感知环境中Ca2+浓度的变化，在结合或释放Ca2+的过程中影响荧光蛋白的构象或位置，从而改变荧光蛋白的激发光或发射光的性质，产生荧光信号的变化，进而指示钙信号。钙指示剂经过了25年的改良，有基于不同原理的各种版本（表2），内容非常丰富，本次伯小远就以基于荧光共振能量转移（FRET）的重组Cameleons钙指示剂YC3.6、基于单荧光强度的GCaMP钙指示剂来给大家介绍一下。
表2 钙离子传感器 (Sadoine et al., 2021)。
YC3.6（Yellow cameleon 3.6）是植物中常见的基于FRET的荧光钙指示剂，由青色荧光蛋白CFP、黄色荧光蛋白YFP、钙调蛋白CaM和肌球蛋白轻链激酶片段M13（M13为CaM靶蛋白序列）构成的，当CaM结合钙离子后，与M13紧密结合，CaM-M13的区域构象由松散变得紧密，使位于Ca2+结合区域两端的CFP和YFP距离变近，发生荧光共振能量转移，FRET信号值变高（图2）。
图2 YC3.6钙指示剂的结构。发生FRET的原因：当两种荧光蛋白即供体荧光蛋白和受体荧光蛋白各自的激发光谱和发射光谱具有重叠区，且二者之间的距离<10nm时，荧光蛋白间可以通过共振的方式进行能量转移，即供体荧光蛋白荧光减弱而受体荧光蛋白荧光增强，可利用供体-受体之间FRET信号的变化来指示细胞内钙信号的变化。所以当钙离子结合CaM后，这个被激活的CaM能够结合M13，使CFP和YFP紧密作用，发生FRET，480nm的荧光减少而530nm的荧光增加。
YC3.6广泛应用于植物Ca2+动力学监测，包括Ca2+信号与根毛、花粉管尖端生长的联系、触摸响应、活性氧（ROS）的体内动态平衡、气孔反应、生长素信号之间的联系等（图3）。
图3 由MIZ1蛋白介导的细胞质基质钙离子信号是拟南芥根尖对水分梯度的响应所必需的 (Shkolnik et al., 2018)。共聚焦显微镜观察Col-0和突变体幼苗的根。该图像为伪彩色图像，红色表示更高的细胞质基质钙离子信号。文中使用的钙指示剂为NES-YC3.6，NES指核输出信号。
▲经过处理后，野生型幼苗根中NES-YC3.6信号的可视化，每隔10min拍摄一次图片。
与基于FRET的Cameleons荧光钙指示剂相比，GCaMP对Ca2+浓度变化更敏感、荧光亮度更强、动态检测范围更大。
GCaMP钙指示剂是指环形排列荧光蛋白cpGFP（circularly permuted GFP）的N末端和C末端分别连接M13和CaM构成的基于荧光强度的钙指示剂。CaM与钙离子结合后发生变构，并以其铰链区和M13结合，三者相互作用引起GFP生色基团周围环境变化，进而引起GCaMP的荧光强度显著增强。不同实验室对GCaMP进行了各种改进和升级（图4左侧），其中，GCaMP3、GCaMP6s在观察植物钙离子流动方面有许多应用（图5）。
图4 在过去20年里，对基因编码钙指示剂（GECIs）的改良 (Walia et al., 2018)。
▲毛毛虫摄食拟南芥叶片产生的钙离子波 (Toyota et al., 2018)。视频中为表达GCaMP3钙指示剂的拟南芥植株。
图5 损伤和谷氨酸盐触发了细胞质基质钙离子波从根到茎的传递 (Shao et al., 2020)。（A）表达GCaMP6s的拟南芥植株在切去主根后在不同时间点的成像；（B）A中第4、5、6片叶中钙离子随着损伤时间的变化而变化；（C）使用100mM谷氨酸盐处理植株，表达GCaMP6s的拟南芥植株在不同时间点的成像；（D）随着谷氨酸盐处理时间的增加，钙离子的变化。
激素
植物激素对植物生长发育的影响非常重要，我们需要通过非侵入的方式研究激素产生的位置、感应方式、运输方式、分布等，各种激素探针在可视化激素分布及动态检测等方面的研究内容非常丰富（表3），下面伯小远仅以生长素和独脚金内酯为例带大家简单了解一下。
表3 各种激素探针 (Isoda et al., 2021)。
注：表中有一部分严格来说不属于基因编码荧光探针，在此未做具体区分。
生长素
至今仍被广泛使用的DR5::GFP系统（图7A）是最先开发的生长素生物探针，DR5启动子中包含多个生长素响应元件（AuxRE），改进后的DR5v2启动子携带对生长素响应因子（ARF）具有更高亲和力的AuxRE，因此更加敏感（图6）。除了以GFP作为报告基因，也可以使用GUS、LUC等作为报告基因。
图6 DR5v2对生长素响应更敏感 (Liao et al., 2015)。（a）含有DR5v2-ntdTomato和DR5-n3GFP两种报告基因的载体示意图，以比较两种启动子对生长素的敏感程度；（b-i）在早期球形胚、心形胚、根尖纵切面、根尖横切面、侧根根冠、根表皮、SAM、嫩叶中显示生长素的分布，红色荧光蛋白代表DR5v2对生长素的响应，绿色荧光蛋白代表DR5对生长素的响应；（j）将上述转基因植株经过2h 10µM NPA（生长素极性运输抑制剂）处理后再施用不同浓度的IAA，qRT-PCR分别检测ntdTomato和n3GFP的转录本；（k）施用1µM IAA，在不同时间分别检测ntdTomato和n3GFP的转录本；（l）同时施用10µM NPA和0、10nM、100nM后观察荧光。
另一种通过蛋白降解的基因编码荧光探针是35S::DII-Venus系统（图7B） (Brunoud et al., 2012)。Aux/IAA蛋白水平的变化直接反映了体内生长素浓度的变化，将Aux/IAA蛋白IAA28蛋白中的生长素依赖性降解结构域II（简称DII）与黄色荧光蛋白变体Venus融合，克隆到组成型启动子CaMV 35S启动子下，在植物体内进行表达可以用荧光强度灵敏地反映生长素浓度。
图7 两种不同的生长素荧光探针原理 (Sauer et al., 2011)。（A）Aux/IAA蛋白与生长素响应因子（ARF）相互作用，抑制ARF转录调节功能的行使，生长素会稳定Aux/IAA蛋白与生长素辅助受体TIR1/AFB的相互作用，TIR1可招募蛋白形成泛素连接酶E3复合体SCF，在高生长素浓度下，Aux/IAA蛋白被泛素化降解，ARFs被释放，ARF结合生长素响应基因（DR5）启动子中的生长素响应元件（AuxREs），激活下游报告基因GFP的表达；（B）DII与Venus融合后组成型表达，原理同上，高浓度生长素会导致DII-Venus泛素化降解，荧光变弱，反之则荧光强度升高。
从上述的原理中我们也可以了解到，DR5::GFP系统的荧光强度与生长素浓度正相关，而35S::DII-Venus系统的荧光强度与生长素浓度负相关，所以常有研究者同时使用两种探针来研究生长素的特性，因为这两种系统赋予的空间格局正好是互补的（图8）。
图8 生长素引发ICR1的快速降解 (Hazak et al., 2014)。这篇文章主要是研究ICR1蛋白与生长素之间的关系，其中，在研究外源生长素能否引发ICR1的降解时，使用0.5μM NAA分别处理表达DII-VENUS、DR5rev::GFP和pICR1>>GFP-ICR1植株的根，结果显示，生长素会在中柱鞘细胞中诱导GFP-ICR1的表达，但另一方面，当生长素在这些组织中积累后，GFP-ICR1又迅速降解。
独角金内酯
独脚金内酯（Strigolactone，SLs）是2008年被发现的一种新型的植物激素，在调控植物分枝、茎干粗细、叶片形态、地下部株型等方面具有重要的作用。
SLs与其受体α/β折叠水解酶DWARF（D14）结合并将其水解成活性形式，激活的D14能促进其与F-box蛋白D3/MAX2和D53/SMXL家族形成蛋白复合物，F-box蛋白招募蛋白并形成泛素连接酶E3复合体SCF，导致D53/SMXL蛋白发生泛素化降解，D53/SMXL降解后，SLs发挥其功能（图9）。有研究者通过对SMXL7蛋白的详细研究，使用SMXL7-YFP作为间接代表SLs的荧光探针（图10）。相比生长素来说，对独脚金内酯的荧光探针研究还比较少，未来还有很大的研究空间。
图9 SLs的信号传导机制 (Waters et al., 2017)。
图10 SMXL7的突变影响了其蛋白本身的稳定性 (Liang et al., 2016)。这篇文章主要是研究SMXL7蛋白在SLs信号传导中发挥的功能，这张图是为了进一步了解SMXL7各结构域的作用，因而对其序列进行了突变，观察了在烟草表皮细胞以及添加rac-GR24的0、20min时拟南芥根部的荧光蛋白情况。这个荧光探针系统的原理类似上述的DII-Venus系统，较高浓度的SL会导致SMXL7-YFP泛素化降解，荧光变弱，反之则荧光强度升高。
NO3-
NO3-对植物的重要性不言而喻（关于硝酸盐转运蛋白NRT1.1的详细内容可查阅文章“一个基因可以发上百篇文章，你敢信？”），但之前检测NO3-的方法，不是缺乏空间分辨率就是使用的局限性太大。由于检测方法的限制，导致根系吸收NO3-的一些最基本的方面是不清楚的，例如哪些组织负责吸收、NO3-是否均匀分布在根部、NO3-的实时运输路径等。
在去年底发表的一篇文章中，研究者使用基于FRET的技术并以细菌的NasR蛋白为基础进行了一系列的优化，开发了一种核定位的基因编码荧光探针nlsNiMet3.0（图11），可以实时观察根系细胞中的NO3-（图12） (Chen et al., 2022)。
图11 NiMet3.0的结构模型 (Chen et al., 2022)。NiMet3.0的结构主要是NasR和两种荧光蛋白，NasR是一种硝酸盐结合蛋白，它通过attB1和attB2接头分别与FRET受体Cerulean（蓝色）和FRET供体Aphrodite（黄色）融合。
图12 核定位nlsNiMet3.0在根细胞中对硝酸盐的响应 (Chen et al., 2022)。由于硝酸盐很容易通过核孔在胞质和核质之间扩散，所以将NiMet3.0加上核定位信号NLS，研究者称之为nlsNiMet3.0，建立其稳定的拟南芥转基因株系，对其5日龄的苗子在添加硝酸盐5min、再去除15min的处理后拍照；结果显示，NiMet3.0显示出对硝酸盐的快速响应，并且当去除硝酸盐后信号是可逆的；（B）将nlsNiMet3.0转入野生型、npf6.3突变体和nia1nia2突变体，对其不进行或进行硝酸盐处理，在植株处于6日龄时对其过渡区和分生组织进行拍照；（C）对B中的图像进行定量分析。结果显示，当野生型株系被硝酸盐处理后，其NiMet3.0发射率更高（可以理解为FRET值更高，代表硝酸盐浓度更高），顶端分生组织比过渡区的NiMet3.0发射率更高；NPF6.3作为将外部硝酸盐转运至根部的主要转运蛋白，其突变体有没有被硝酸盐处理NiMet3.0发射率差别不大；nia1nia2突变体被硝酸盐处理后，其NiMet3.0发射率更高，过渡区中比顶端分生组织的NiMet3.0发射率更高，这个结果与之前的研究结果即根部有一个NIA1/NIA2蛋白活性水平较高的区域是相符的。以上结果表明NiMet3.0适合测量硝酸盐在植物中的分布。
伯小远之前在“一个基因可以发上百篇文章，你敢信？”中提到过，不同于以往认为NRT1.1是主要的硝酸盐感受器，Liu等认为NLP7为主要的硝酸盐感受器 (Liu et al., 2022)，研究者除了研究NLP7作为感受器的功能，其实在这篇文章中也报道了一种新的基因编码荧光探针sCiNiS，该系统可以实时观察植物细胞中的NO3-。
将柠檬黄荧光蛋白mCitrine分为两段即N-mCitrine和mCitrine-C，分别连在NLP7的两端，构成了硝酸盐探针sCiNiS。当存在硝酸盐时，胞内的sCiNiS结合硝酸盐后会改变构象，而柠檬黄荧光蛋白在蛋白构象改变后会恢复活性，重新发出荧光信号（图13）。
图13 基因编码荧光探针sCiNiS可以检测细胞内的硝酸盐 (Liu et al., 2022)。（A）硝酸盐探针sCiNiS的载体结构示意图，将NLP7的核定位信号RRKKK突变为AAAAA，以避免与硝酸盐诱导的内源性NLP7竞争；（B）子叶叶肉细胞的胞质硝酸盐的成像；（C）根尖细胞的胞质硝酸盐的成像。
小远叨叨
基因编码荧光探针方面的研究内容非常非常丰富，由于篇幅所限，除了上面简介的钙离子、激素、NO3-，还有ROS、H2O2、H+、NH4+、ATP、pH等在植物学研究中常需要被检测的物质也有相应的基因编码荧光探针，大家在平时的基因功能研究中如果有需要可以尝试使用一下喔！
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