飞秒脉冲激光束聚焦到主体元素人头大脑上，其中并列的三个脉冲表示三光子激发，大脑中的闪光点表示多光子荧光成像技术在脑结构和功能成像解析中的广泛应用。大脑皮层的局部放大，展示近红外二区激发下的多光子荧光成像可以实现深脑区中的血管网络和神经元动态高分辨成像
一 背景介绍
多光子荧光显微成像技术基于近红外光源激发的多光子吸收效应，具有深穿透、高时空分辨、高信噪比和低侵入性等特点，在活体深层组织成像中被广泛使用[1]。相比与传统的单光子荧光成像中所使用的紫外可见光光源，近红外光的引入极大地提高了多光子荧光成像的穿透深度。近些年来，位于近红外二区（1000~1700 nm）的光源由于在生物组织中具有更小散射和更大的穿透能力，进一步提高了生物成像的深度。
二 基本原理和系统
2.1 多光子荧光原理
当染料分子在短时间内吸收两个或者更多个光子能量后会被激发到激发态，经过内部转换之后从激发态回到基态，同时以荧光发射的形式释放能量，这就是多光子荧光产生的基本原理，如图1(a)。
一般情况下，使染料分子在极短时间内吸收多个光子并不容易，一般使用超短飞秒脉冲激光器作为光源，其具有较高的单脉冲峰值功率，可以实现高效率的多光子吸收。
多光子吸收是一个高阶非线性过程，荧光强度与激发光强度的二次方（双光子吸收）或者三次方（三光子吸收）成正比，只有在聚焦点处才会产生多光子荧光。这种特点也就从根本上避免了单光子荧光（线性激发）中离焦信号对成像带来的背景噪声，使多光子荧光成像在激光扫描模式下具有了三维层析成像的能力，如图1(b)。
多光子荧光显微镜主要包括激发光源、扫描模块、物镜和探测器（图1c）。扫描模块在XY方向上扫描聚焦激光得到一个由多个单像素点所构成的二维图像，然后在Z方向上得到不同层面的二维图形，进而重构出样品的三维图像。常用的双光子专用物镜其数值孔径为1，工作距离为2 mm，放大倍数在20–30倍。除此之外，物镜也需要考虑近红外光的穿透率，以减少激发光源的损耗。在多光子显微镜中使用的探测器主要是可实现单像素探测的光电倍增管。光电倍增管灵敏度高，增益大，光敏区域大，量子效率也比较高，响应速度快，暗电流小，非常适合对微弱的多光子荧光信号的采集。
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图1 多光子荧光成像原理和系统
（a）多光子吸收激发荧光能级图；（b）线性和非线性激发荧光信号空间分布[2]；（c）激光扫描多光子荧光显微镜系统示意图
2.2 近红外光源
光在生物组织中的吸收和散射效应是影响其传播的最主要的因素。生物体对紫外可见光吸收较强，但是对近红外光的吸收较弱。随着光波长的增加，生物组织对光的散射系数逐渐减小，如图2（a），综合考虑吸收和散射对光的衰减效应，得到了光在脑组织中的有效衰减长度（图2a）[3]。可以看出，700~1300 nm和1700 nm附近是最优的穿透波长，也就是 “组织光学窗口”；近红外光根据在组织中的传播特性分为两部分（图2b）——近红外一区（NIR-I，700~950 nm）和近红外二区（NIR-II，1000~1700 nm）。NIR-II比NIR-I有更小的散射，且衰减长度更长，所以NIR-II在多光子荧光成像中是较好的“组织光学窗口”，且1300 nm和1700 nm附近波段是最优激发光波长。
钛蓝宝石飞秒脉冲激光器使用简便、稳定性高、波长易调谐（690~1040 nm），其波长覆盖了NIR-I窗口，可满足商业化荧光染料以及非标记成像的双光子激发，被广泛应用于双光子荧光显微镜中。为进一步提升成像的深度，钛蓝宝石激光器也可作为泵浦光源，在光参量振荡器（OPO）或者光参量放大器（OPA）的辅助下会出射NIR-II波段。
此外，具有固定波长的光纤飞秒脉冲激光器也在多光子成像中受到关注。目前较为成熟的是在1000 nm波段的掺镱光纤激光器和在1500 nm波段的掺铒光纤激光器，利用自相位调制或者孤子自频移等技术可以将波长扩展至多光子成像的最优光学窗口：1300nm和1700 nm波段。
图2
（a）近红外光在脑组织中的衰减长度[3]；（b）近红外一区和二区光源激发下的活体多光子脑成像示意图
三 应用研究
3.1大深度脑血管网络和神经成像
相比于临床上广泛使用的功能核磁共振成像和计算机断层成像，多光子荧光成像技术可以实现高至细胞级精度的活体成像分辨率。利用荧光蛋白、有机和无机荧光染料对血管进行标记，在1300 nm和1700 nm飞秒光源激发下可实现对小鼠大脑血管网络的高分辨双光子和三光子荧光成像，目前成像深度达2 mm左右。在钙离子指示剂的辅助下，也可以利用多光子荧光成像对深脑区的神经元形貌和动态活动进行成像和监测。最近，Hontani等[5]报道利用单一近红外二区激光（1300 nm）激发实现了多色的三光子荧光脑血管和神经成像，如图3所示。
图3 1300nm激发下的多色三光子荧光脑成像
3.2 经颅脑成像
要实现对超过1 mm深度的脑区进行多光子成像，需要对大脑的颅骨进行去除或打磨变薄处理，以减少颅骨对于光的衰减。为了实现真正意义上的非侵入性光学成像，利用NIR-II光源在组织中的低散射优势，实现经颅脑成像，如图4所示。在高性能的荧光探针辅助下，NIR-II激发下的成像信噪比更高，在颅骨完整的情况下可以对颅骨内的细胞和血管进行双光子成像，实现对大脑皮层的血管网络高速双光子成像
图4近红外二区激发下的经颅双光子脑成像
（a）不同波长激发下的成像信噪比比较；（b）脑颅骨内成像；（c）经颅脑皮层血管网络成像
3.3 肿瘤和心血管疾病多光子成像
多光子荧光成像技术可在活体中对肿瘤微环境进行高分辨成像，如图5（a）。和正常组织血管相比，肿瘤血管具有膨胀和扭曲的形貌以及高度异质性，利用高分辨的活体多光子荧光成像可将术后这些残留的微小肿瘤组织识别出来[6]。此外，利用特异性标记脂质的荧光探针，多光子荧光成像成功应用到了活体水平心脑血管动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝等慢性疾病的检测当中[7]，如图5（b）
图5肿瘤和心血管疾病多光子荧光成像[
（a）肿瘤血管双光子成像；（b）动脉粥样硬化斑块和脂肪肝三光子成像
四 总结和展望
近红外光源的使用，是多光子荧光成像最大的优势之一，加之非线性的多光子激发，使其在生物活体细胞分辨级的深层组织三维成像中扮演着不可替代的角色。多光子荧光成像技术不仅为脑科学的研究做出巨大贡献，也逐渐在其他重大疾病的基础性研究中崭露头角。随着荧光染料性能的不断提升，加之高功率的飞秒脉冲激光器的发展，近红外二区激发下的双光子成像、三光子成像，或者两者融合的成像技术必定会为脑科学和重大疾病的大深度、高分辨、高信噪比成像带来更大的发展和突破。
公司简介：沈阳莫德医药科技有限公司，由行业资深人士组成研发团队，专业研发制造近红外二区小动物活体荧光成像系统，有需求随时沟通，欢迎合作。
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相机部分：
1、InGaAs 成像模块采用TEC电制冷方式，芯片工作温度达到-60℃或更低，且芯片工作温度可调；
2、InGaAs成像模块有效像素数量不少于640 x 512，每个像元尺寸不小于15微米；
3、InGaAs成像模块在900-1700nm具有高灵敏度，量子效率不低于70%；
4、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；
5、能够实现近红外二区与彩色可见光的实时同步成像，且精确融合图像能够实时展示。
6、近红外二区成像具备过曝光预警功能。成像窗宽窗位可手动自由调节。且具备灰度图像自动增强功能。
7、可见光成像部分具备自动增益，自动曝光，自动白平衡功能，能够自动进行伽马矫正。融合算法先进，用户可以根据需求确定近红外与可见光融合的有效阈值。
8、红外图像、可见光图像和二者融合图像可以同时显示。拍照和录像数据可一键采集，且拍照和录像保存后可再次进行后续数据分析并不失融合。
9、成像参数与激光激发参数能够自动保存。
激光部分：
1、荧光激发光源采用两种波长激光光源（808nm, 980 nm），功率可调且总功率≥20瓦；
2、每种荧光激发光源各采用两根液芯匀光光纤，分布两侧，保证无死角照射。
3、每根光纤末端配备准直器，可调整荧光激发光的均匀照射。
4、可通过系统软件实现激光控制。
5、激光参数自动保存在成像参数中。
暗室及控制系统：
1、标配软件具备成像参数设置功能，如曝光时间、增益、相机工作温度、内外触发等，具备红外成像窗宽/窗位手动和自动调节功能；
2、可通过软件去除背景，实现成像的平场校正等功能；
3、能够实现100μs寿命材料的荧光寿命成像；
4、可同时装载至少5个发射光滤片，标配滤片数量不少于4个；
5、具备荧光寿命成像专用软件模块，可通过软件调节激发光照明时间、相机曝光时间和激发光与相机曝光间隔时间，具有延时成像能力；
6、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差在10μs以内；
7、具备5通道以上小动物气体麻醉功能；
8、能够实现小鼠全身成像和局部成像，视野范围可调，最大视野范围不小于10cm x 8cm；
9、动物载物台可电控升降，行程不小于50cm；
10、动物载物台具有加温保暖功能；
应用：
适合从事生物学、医学、天文学等科研工作者，特别适用于生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、天文成像和激光光斑分析等多种科研领域及军事、高端安防等应用领域。
