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今天，我们一起来解读这篇2022 Dec 27发表在Cell Rep （IF 9.995 1区）上的文章，题为“The loss of epithelial Smad4 drives immune evasion via CXCL1 while displaying vulnerability to combinatorial immunotherapy in gastric cancer”。本文发现，在胃癌中，上皮Smad4的缺失通过CXCL1驱动免疫逃逸，同时在癌症中表现出对组合免疫治疗的敏感。本文论证逻辑严谨，层层递进，不失为免疫学领域研究的学习模范。
免疫疗法/免疫检查点阻断(ICB)在治疗癌症方面取得了很大进展。然而，ICB治疗仅对一部分患者有效。越来越多的证据表明，免疫抑制性肿瘤微环境（TME）是导致不同癌症情况下ICB治疗无效的主要因素。由驱动基因突变驱动的癌细胞内在机制发挥免疫抑制作用，促进对癌症免疫治疗的抵抗。【小编有话说：经常看肿瘤免疫相关文章的老师，这段话，差不多会背了吧】。
胃癌(GC)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤。SMAD4在人胃癌(GC)中经常发生突变和失活。约10%的GC肿瘤具有SMAD4基因的遗传改变。SMAD4是一种肿瘤抑制因子，是转化生长因子β（TGF-β）信号传导的关键转录因子。【SMAD4很熟悉的分子】。
作者前期研究使用转基因小鼠（GEM）模型证明了SMAD4缺失作为GC发展和转移的驱动因素的作用。其他研究表明，Smad4缺陷的肠道肿瘤招募CCR1+髓细胞和肿瘤相关中性粒细胞，以促进免疫抑制性TME。然而，尽管Smad4的上皮细胞自主功能已被广泛研究，但其对肿瘤免疫的贡献在很大程度上尚未确定。Smad4在GC抗肿瘤免疫调节中的作用仍有待确定。【创新之处】
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在这里，作者报道了Smad4在GC细胞中表达的缺失赋予了它们逃避肿瘤免疫的能力。与Smad4-proficient counterparts不同，Smad4缺陷的胃类器官可以逃避免疫，在具有免疫能力的小鼠中形成肿瘤。Smad4缺陷的GC细胞显示CD133+癌干细胞样细胞扩增，同时通过含有CXCL1的分泌体抑制树突状细胞（DC）分化和细胞毒性T细胞的粒细胞髓源性抑制细胞（G-MDSC）聚集。此外，Smad4缺陷增加PD-L1的表达，降低4-1BBL表达，表明免疫原性发生变化。抗PD-L1和抗CTLA-4或激动性抗4-1BB抗体的组合可有效治疗ICB单药耐药Smad4缺陷同种异体移植物。总的来说，这些数据为ICB治疗Smad4缺陷的晚期胃癌提供了合理的依据。
亮点可总结为：
上皮细胞Smad4的缺失促进GC的免疫逃逸；
Smad4缺陷增加了癌干性，通过CXCL1抑制树突细胞（dendritic cell，DC）；
Smad4缺陷改变了免疫检查点分子4-1BBL和PD-L1的表达；
ICB和4-1BB激动剂联合治疗对Smad4缺陷性胃癌有效。
作者的论证逻辑
上皮Smad4表达缺失促进免疫逃逸-Loss of epithelial Smad4 expression promotes immune evasion
利用Trp53f/f；Cdh1f/f；Cas9 GFP Tg/Tg小鼠（图1A），制备Cdh1−/−Trp53−/−(CP)和Cdh1−/−Trp53−/−Smad4−/−(CPS)小鼠胃类器官（图1B）。
（图1C）：Normal；Cdh1& Trp53 KO (CP#1)；Cdh1& Trp53 GFP KO (CP#2)；Cdh1& Trp53 Smad4 KO (CPS)。有效的CRISPR-Cas9基因编辑通过GFP靶向gRNA的共转导导致的GFP荧光损失（图1C）反映，并通过桑格测序分析证实。Western blot分析显示CPS类器官中Smad4和E-cadherin表达完全丢失（图1D）。
Figure 1 Smad4 deficiency induced immune evasion
当皮下（s.c.）移植到免疫受损的NSG小鼠中时，CP和CPS类器官在3周后均发生肿瘤，后者形成更大的肿瘤（图1E和1F）。
当被原位（o.t.）移植到具有免疫能力的同源小鼠中时，与移植了CP克隆相比，移植了CPS克隆的小鼠显示出存活率显著降低（图1G和1H）。在o.t.移植后，用CP#2类器官移植的小鼠未能完全发育出肿瘤，同时30%的移植CP#1类器官6.4个月形成的肿瘤比CPS类器官小得多（图1I和S2）。再提及一下分组：Normal；Cdh1& Trp53 KO (CP#1)；Cdh1& Trp53 GFP KO (CP#2)；Cdh1& Trp53 Smad4 KO (CPS)。
皮下移植时，CP类器官在NSG小鼠中肿瘤生长不减，在同源小鼠中显示出生长受限，并在6周内消退（图1J Growth curves of CP #1 organoids after s.c. transplantation in NSG and C57BL/6 mice）。这些结果提示，Smad4-proficient的CP类器官被免疫系统有效地靶向。
在之前的一项研究中，Smad4−/−Trp53−/−Cdh1F/wt GC细胞(称为S1M细胞)，当皮下s.c.移植到具有免疫能力的同源小鼠体内时，容易形成肿瘤。
为了研究Smad4对肿瘤免疫的影响，作者利用该细胞模型，并使用PiggyBac转座子系统在内源性水平引入外源性Smad4 (S1MSmad4−OE)(图1K)。重新引入Smad4可以消除S1M细胞在同源小鼠中的致瘤性，尽管它们在NSG小鼠中继续形成肿瘤(图1L)。
作者进一步建立了S1Mtet−Smad4系，在皮下s.c.肿瘤建立后允许多西环素诱导的Smad4表达(图1M)。多西环素处理对S1Mtet−Smad4细胞的体外生长无影响(图S3B)。然而，与载体治疗相比，多西环素在体内抑制了s.c. S1Mtet−Smad4肿瘤的生长(图1N)。免疫组化染色显示，不同处理的S1Mtet−Smad4异体移植物Ki-67阳性无显著差异(图S3C和S3D)。综上所述，这些数据揭示了上皮细胞Smad4在TME中调节抗肿瘤免疫的作用，在免疫能力强的宿主中，Smad4的缺失导致免疫逃逸，而Smad4的恢复将阻止肿瘤的生长。
Smad4缺失会损害树突细胞（DC）分化和CD8+ T细胞浸润-Loss of Smad4 impairs DC differentiation and CD8+ T cell infiltration
为了了解Smad4-proficient细胞在具有免疫能力小鼠中的排斥基础，作者检查了树突状细胞(DC)数量，以确定交叉致敏(cross-priming)（也称抗原的交叉提呈(cross-presentation)）是否被改变。
在Smad4缺陷的S1M细胞s.c.移植后，前2周内观察到脾脏CD11C+ DC总数增加，但同时伴有成熟的主要组织相容性复合体(MHC) II类+ DC数量的减少(图2A和2B)。
相反，在S1Mtet−Smad4异体移植物中，多西环素诱导外源性Smad4表达增加脾脏MHC II+ DC数量(图2C)。此外，多西环素诱导Smad4后瘤内DCs数量也增加(图2D)。为了验证这一发现，作者接下来研究了Smad4 WT和KO肿瘤的体内免疫成分。由于CP类器官在具有免疫能力的小鼠中很少发生肿瘤，作者分别从CP和CPS异体移植中获得了高致瘤性GC系CPAD和CPSAD(图1J和S4)。在C57BL/6免疫能力小鼠中，s.c. 注射后CPAD和CPSAD细胞都容易发生肿瘤。在移植CPSAD的小鼠中，脾成熟MHC II类+ DCs的比例低于移植CPAD的小鼠(图2E)。作者利用TIMER数据库探索了人GC中DC浸润与SMAD4状态的相关性，观察到SMAD4表达与DCs数量呈正相关(图2F)。此外，与SMAD4二倍体GCs相比，SMAD4缺失的人GCs具有更少的DCs(图2G)，突出了临床相关性。
Figure 2 Suppression of DC differentiation upon Smad4 loss
然后，从同源小鼠中提取骨髓细胞，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在下体外培养，研究其向DCs的分化。与体内观察结果一致，由Smad4缺陷的S1M细胞产生的条件培养基(CM)显著抑制MHC II类+ DCs的成熟。此外，在与来自S1M Smad4−OE细胞的CM共同处理后，这种情况得到恢复(图2H)。smad4缺乏的CPSAD和smad4充足的CPAD产生的CM也观察到了类似的效果(图2H)。这些发现提示Smad4缺失的GC细胞的分泌体抑制DC的分化和功能。
为了识别分泌体中潜在的抑制分子，作者对CPS和CP类器官进行了RNA测序，在CPS中使用1.5倍阈值(p < 0.05)发现了457个上调的差异表达基因(DEGs)(表S1)。Smad4缺陷小鼠GC细胞的CMs质谱分析证实了该列表中的11种蛋白质(图2I)。
在这11个基因中，作者从TIMER数据库中观察到趋化因子(C-X-C motif)配体1 (CXCL1) mRNA的表达与人类GC样本中DCs的数量呈负相关(图2J)。CXCL1是一种趋化刺激因子，在包括GC在内的几种恶性肿瘤中过表达，与不良预后相关。RT-qPCR分析和ELISA检测证实，在smad4缺陷的CPS类器官和对照S1M细胞中，Cxcl1 mRNA的表达水平和Cxcl1在CM中的表达水平分别高于CP类器官和S1M Smad4−OE细胞(图2K-2N)。最后，原位杂交(ISH)分析显示Cxcl1主要表达于CPS原位类器官肿瘤和Cdh1F/+;Trp53F/F;Smad4F/F小鼠原发肿瘤的GC细胞中(图2O)。在功能上，重组小鼠CXCL1以剂量依赖的方式抑制来自骨髓细胞的MHC II类+ DCs的成熟(图2P)。与对照CM相比，CPSAD和S1M细胞(过表达CXCL1)的CMs降低了MHC II类+ DCs的比例(图2Q和2R)，而CXCL1中和抗体减弱了CXCL1对DC分化的抑制作用(图2S)。总的来说，这些结果表明来自smad4缺陷GC细胞的CXCL1有助于抑制DC分化。
Smad4缺失导致G-MDSCs的积累和T细胞活性的丧失-Smad4 loss results in the accumulation of G-MDSCs and loss of T cell activity
作者观察到SMAD4表达与人GCs中粒细胞髓源性抑制细胞(G-MDSCs)数量呈负相关(图3A)。【MDSCs，髓系抑制性细胞，是骨髓来源的一群异质性细胞，是DC细胞、巨噬细胞和粒细胞的前体，具有显著抑制免疫细胞应答的能力，具有负向调控免疫应答能力的异质性细胞。】此外，SMAD4缺失的人类GCs比SMAD4-二倍体GCs具有更多的MDSCs(图3B)。皮下移植后，S1M皮下同种异体移植物2周后形成，4周后呈指数增长(图3C)。CD11b+ Ly6c+ Ly6g+ G-MDSCs，已知抑制效应T细胞活化，在S1M s.c.移植4周后急剧增加(图3D)。同样，与CP移植相比，CPS同种异体移植诱导脾脏中G-MDSCs的比例更高(图3E)。相反，多西环素治疗降低了移植S1Mtet−Smad4 s.c.异体移植物小鼠脾脏G-MDSCs的百分比(图3F和3G)。最后，S1M细胞移植小鼠脾G-MDSC数量与原发肿瘤体积呈强正相关(图3H)。
与G-MDSC聚集的爆发相一致的是脾脏中CD8+细胞毒性T (Tc)细胞的急剧下降(图3I)。与此一致的是，S1M移植小鼠的颗粒酶B+脾Tc细胞在移植4周后低于对照小鼠观察到的水平，尽管最初有所增加(图3J)。
为了评估这种变化的功能相关性，在移植后10天和>4周从S1M移植小鼠中分离脾Tc细胞。在体外与S1M细胞共培养时，从移植后>4周小鼠分离的Tc细胞的细胞毒性恢复到正常小鼠Tc细胞中观察到的基线细胞毒性(图3K)。综上所述，这些数据表明Smad4的缺失导致G-MDSC在肿瘤发生晚期积累并抑制Tc细胞活性。
Figure 3 G-MDSC accumulation and reduced cytotoxic T cell ac
Smad4缺乏导致癌干性增加和免疫抑制-Smad4 deficiency leads to increased cancer stemness and immune suppression
为了确定由于Smad4缺失导致的基因表达变化，比较了(1)CP和CPS类器官，(2)CP和CPS同种异体移植物来源的肿瘤细胞，以及(3)未处理和多西环素处理的S1Mtet−Smad4细胞之间的差异调节基因(图4A)。作者利用TIMER研究了人类GC中上调基因与DC和Tc细胞浸润之间的相关性(图4B)。在Smad4缺失诱导的上调基因中，癌症干细胞(CSCs)的标记物CD133/Prominin-1与CD8+ T细胞浸润和激活的DCs呈最强的负相关(图4C)。CSCs通过对包括DCs、MDSCs和肿瘤浸润淋巴细胞在内的免疫细胞发挥调节作用，已成为癌细胞免疫逃逸的关键角色。为了验证这一发现，作者测量了CD133的表面表达，并观察到与CP类器官相比，缺乏smad4的CPS类器官中CD133+亚群显著增加(图4D)。此外，与对照细胞相比，S1M Smad4−OE细胞中的CD133+细胞减少(图4E)。作者通过荧光激活细胞分选(FACS)，基于CD133+的表达，对S1M细胞进行了分类(图4F)。体外培养CD133+ S1M细胞2周，去除细胞表面CD133抗体。CD133+亚群在这些细胞中的比例高于亲本parental S1M细胞，标记为CD133high S1M(图4F)。CD133high S1M 细胞比亲本S1M细胞形成更多的肿瘤球(图4G)，表明CD133+细胞表现出更强的癌干性和细胞可塑性。与此一致的是，在同源免疫能力强的小鼠中，CD133high S1M细胞比亲本细胞更早产生肿瘤，生长更快(图4H)。值得注意的是，CD133high S1M异体移植物较少被MHC class II+ DCs 和颗粒酶+ Tc细胞浸润(图4I和4J)，而与亲代S1M异体移植物相比，G-MDSCs浸润更多(图4K)。重要的是，CD133high S1M细胞比亲代S1M细胞分泌更多的CXCL1(图4L)。综上所述，这些结果表明Smad4缺乏通过增加癌干性来抑制肿瘤免疫，从而驱动肿瘤发生。
Figure 4 Increased stemness associated with the suppression
通过改变smad4缺陷GC中的免疫检查点分子(包括4-1BBL和PD-L1)来改变免疫原性-A change in immunogenicity by altering immune checkpoint molecules including 4-1BBL and PD-L1 in Smad4-deficient GC
为了进一步了解Smad4缺失后免疫逃逸的分子基础，作者基于RNA测序(RNA-seq)分析，使用在CP和CPS类器官中2倍或更多差异表达的基因进行了基因集富集分析(GSEA)(表S1)。这表明代谢途径发生了最显著的改变(图5A)。值得注意的是，肿瘤坏死因子超家族成员9 (TNFSF9)，也被称为4-1BBL，是一种T细胞共刺激分子，因其在癌症免疫治疗中的应用而被广泛研究。RT-qPCR证实CPS类器官中4-1BBL下调(图5B)。此外，通过RT-qPCR和流式细胞术检测，S1M Smad4−OE细胞中4-1BBL mRNA和蛋白的表达高于对照组S1M细胞(图5C和5D)。这些结果表明Smad4正调控上皮细胞4-1BBL的表达。同时，过表达4-1BBL的CPSAD细胞在同源小鼠中的生长速度比对照细胞慢(图5E和5F)，支持4-1BBL表达在Smad4-proficient细胞的免疫排斥反应中的功能贡献。这些数据也提出了Smad4缺陷可能通过改变免疫检查点分子来调节免疫原性的可能性。其中，PD-1/PD-L1轴被认为是肿瘤免疫逃逸策略的主要参与者，以抑制CD8 T细胞的细胞毒性。流式细胞仪分析显示，PD-L1在CPSAD细胞和S1M细胞中的表达水平也分别高于CPAD细胞和smad4过表达的S1M细胞(图5G和5H)。Pembrolizumab(抗PD-1)单药治疗在PD-L1阳性细胞相对比例较高且>阳性评分为1的GC患者中具有显著的临床生存益处。通过免疫组化(IHC)分析，作者确定smad4缺陷的S1M异体移植物PD-L1联合阳性评分为>2(图5I)。这些结果表明Smad4负向调控上皮PD-L1的表达。另一方面，与smad4正常的GC细胞相比，smad4缺乏的GC细胞中MHC分子的表达没有显著改变(图S5)。总的来说，这些数据表明，除了上皮细胞Smad4丢失通过增加CXCL1分泌产生的非细胞自主效应外，肿瘤免疫逃逸也部分通过改变免疫检查点分子而改变细胞免疫原性来介导。
Figure 5 Alteration of immune checkpoint molecules upon Smad4 loss
Smad4缺陷的胃肿瘤在体内对ICB单药治疗表现出耐药性，尽管在体外有疗效-Smad4-deficient gastric tumors exhibit resistance to ICB monotherapy in vivo despite in vitro efficacy
总的来说，这些数据提高了smad4缺陷GC可能对4-1BB激动剂抗体或抗PD - L1免疫治疗有反应的可能性。由于4-1BBL和PD-L1是调节抗肿瘤T细胞反应的免疫检查点分子，作者将Smad4 -proficient或缺乏的细胞与从预先免疫肿瘤细胞14天的小鼠中分离出来的Tc细胞共同培养(图5J)。作者发现，与对照组S1M细胞相比，重新引入Smad4 (S1M Smad4−OE)导致Tc细胞毒性增加(图5K)。此外，Tc对CPAD细胞的细胞毒性杀伤比CPSAD细胞更明显(图5L)。此外，通过4-1BB激动剂抗体或PD-L1阻断抗体，Smad4缺失后T细胞介导的细胞毒性降低得以恢复(图5M)。然而，尽管在体外共培养系统中对这些抗体有反应，由S1M或CPSAD GC细胞产生的s.c.异体移植物对抗PD-L1治疗无效(图5N和5O)。此外，激动性4-1BB抗体对S1M或CPSAD GC细胞产生的s.c.同种异体移植物的肿瘤生长没有抑制作用(图5P)。这些数据与体内特定观察到的微环境可能会限制ICB单药治疗Smad4缺陷小鼠GC的疗效的观点一致。
组合ICB有效靶向smad4缺陷GC--Combinatorial ICB effectively targets Smad4-deficient GC
作者认为抗PD - L1治疗无效的根本原因是肿瘤部位Tc细胞浸润减少。事实上，在S1Mtet−Smad4异体移植物中，多西环素诱导外源性Smad4表达增加了肿瘤部位的CD8+ T细胞(图6A)。TCGA-STAD数据集的TIMER分析支持了这一点，在人类GCs中可以观察到SMAD4表达与Tc细胞数量之间的正相关(图6B)。与此一致的是，SMAD4缺失的人类GCs比SMAD4-二倍体GCs具有更少的Tc细胞(图6C)。为了克服抗PD - L1单药治疗的耐药性，作者测试了与4-1BB激动剂抗体的联合治疗，以增强免疫交叉启动和T细胞激活。重要的是，在smad4缺陷的S1M和CPSAD异体移植物模型中，抗PD-L1和激动性4-1BB抗体联合治疗可协同抑制肿瘤生长(图6D和6E)。值得注意的是，抗PD - L1和激动性4-1BB抗体联合给药显著增加了肿瘤部位Tc细胞的浸润(图6F和6G)和脾脏中T细胞的扩增(图6H)。
为了进一步评估增强DC/T细胞轴的策略，作者应用了CTLA-4阻断抗体，通过增强幼稚T细胞的启动来促进肿瘤排斥反应。抗PD - L1和CTLA-4联合治疗协同抑制s.c. S1M异体移植物的生长(图6I)。流式细胞术分析证实，共治疗组脾脏CD8+ Tc细胞比例显著增加(图6J)，同时脾脏G-MDSCs显著减少(图6K)。此外，抗PD - L1和CTLA-4联合治疗协同抑制s.c CPSAD异体移植物的生长(图6L)，尽管协同作用不如激动剂4-1BB抗体和抗PD - L1联合治疗，这表明后者可能是治疗Smad4缺陷GCs更有效的策略。有趣的是，与单一治疗相比，抗CTLA4和抗PD - L1抗体联合治疗并没有进一步提高对CPAD异体移植物的抗肿瘤活性(图6M)，这提供了CTLA-4抑制特异性针对Smad4缺失导致的免疫逃逸机制的证据。
Figure 6 Combined immune checkpoint blockade for treating Smad4-deficient GC
小结
这篇文章是老外的文章，整体论证逻辑环环相扣，不失为免疫学领域研究的学习典范。不管是从题目，还是本文的主要亮点上来看，胃癌，Smad4缺陷，CXCL1，DC/T细胞轴，免疫治疗是关键。小编偶然间发现一篇2019年发表的文章，影响因子为13.801，该文发现人结直肠癌癌症细胞SMAD4基因敲除上调了CXCL1和CXCL8的表达，从而通过CXCR2向癌症肿瘤招募中性粒细胞。但是这篇2022年发表的文章未进行引用和讨论。算是一个小Bug吧。
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